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Mise en évidence de l’influence de la concentration en substrat sur la vitesse de réaction enzymatique

mercredi 21 janvier 2015 [ télécharger l'article au format PDF]
Pour évaluer cette influence on utilisera l’oxymétrie, puisque que chaque réaction conduit à la production d’un O2.

Matériel

- solutions de glucose de concentrations différentes (0,25g/L ; 1g/L ; 3g/L ; 5g/L), une solution de concentration inconnue, appelée "sérum à tester" (à déterminer) correspond au sérum du chercheur
- solution d’enzyme GOD [1] (à prélever avec la seringue) ;
- Matériel ExaO (ordinateur, interface d’acquisition, capteurs, logiciel de traitement..)
- Bioréacteur, seringue, éprouvette graduée.

Paramétrage du logiciel d'acquisition

- 1→ On utilisera le module généraliste

[Remarque : Dans la fenêtre qui s’ouvre, vous pouvez faire apparaître le nom des adaptateurs connectés à votre interface en positionnant la souris à droite des capteurs jusqu’à l’apparition d’une double flèche. Faire un clic gauche et déplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic.]

- 2→ Placer l’adaptateur oxymètre sur l’axe des ordonnées en cliquant sur l’icône « Oxymètre » puis en déplaçant la souris en maintenant ce clic (1).

[Remarque : Les 6 points d’accroche sur l’axe des ordonnées étant équivalents, vous pouvez donc placer l’adaptateur oxymètre sur celui de votre choix.]

- 3→ De même positionner l’icône « Temps » sur l’axe des abscisses (2)

- 4→ Paramétrer les capteurs :

    • vérifier que l’oxymètre soit sur "liquide" (cliquer sur l’icône, onglet calibre puis liquide) [2]
    • Régler la durée d’acquisition sur 5 minutes [3] (→).

Réalisation de l'expérience

- 1- Remplir la cuve du bioréacteur avec la solution de glucose 0,25g/l de façon à faire déborder la cuve une fois le couvercle positionnée (environ 13 ml) [4]. Prélever les solutions avec votre éprouvette graduée.

- 2- Brancher le bioréacteur et lancer l’agitation.

- 3- Placer la sonde 02 dans l’enceinte par l’un des emplacements situés dans le couvercle du bioréacteur. Eviter d’utiliser l’emplacement central sous lequel se trouve l’agitateur.

NB : La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioréacteur ! Elle dispose d’un joint noir qui permet de l’éviter.

- 4- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton « Lancer »

- 5- Au temps 1 min (TOUJOURS AU MÊME INSTANT !! POUR COMPARAISON, injecter (à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’un cathéter) 0,5 ml de GOD dans la cuve du bioréacteur.

NB : un petit orifice est prévu à cet effet dans le couvercle du bioréacteur, ce qui évite d’ouvrir le couvercle…

- 6- Mettre un repère sur l’axe des temps, en appuyant sur la barre d’espace, attendre la fin de la réaction ( 4 minutes)

- 7- Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge s’il y a lieu.

N.B. : une fois l’expérience terminée, enlever le couvercle de l’enceinte et rincer très soigneusement à l’eau distillée, la sonde, l’agitateur, le couvercle et la cuve. Il faut en effet enlever toute trace de GOD.

- 8- Utiliser le même protocole (1 à 7) que précédemment pour les différentes concentrations de glucose à tester. Manipuler dans le sens croissant des concentrations. Pour chaque expérience, choisir la superposition de la courbe aux précédentes :

- 9- On prendra soin d’annoter les différentes courbes en cliquant sur l’icône « Annotation d’une courbe ».
(1) Titre
(2) Choix de la courbe à annoter
(3) Annotation à insérer sur la courbe choisie
(4) Insérer l’annotation en cliquant gauche sur la courbe

NB : Une vidéo de 98 sec qui explique tout cela, mais si vous n’avez pas le temps contentez vous de ce qu’il y a ici...

Résultats de la manipulation

__Résultats attendus____

Vous avez obtenu une variation de la concentration en O2 en fonction du temps, mais il ne s’agit pas encore de la vitesse de la réaction. C’est la pente de vos courbes qui permettra cette évaluation.

Vous avez en fait autant de courbe que de concentration en glucose :
[O2]=F(t)

On veut :

V=\fracdO_2dt

Exploitation des résultats

Il faut calculer les pentes de vos courbes, pour obtenir la vitesse initiale, il faut donc repérer une zone qui succède à l’injection et qui présente la décroissance caractéristique.

> Avec l’« Outils » « Pointeur » (obtenu par clic droit sur une courbe, le résultat ici)
> Faire un clic gauche sur un premier point (dans un petit carré jaune apparaissent les valeurs de l’abscisse et de l’ordonnée pointée) sans lâcher la souris faire glisser le pointeur sur la courbe ; dans le deuxième cadre jaune sont donnés dx et dy qui vous permettent de calculer la pente donc la vitesse de la réaction enzymatique.
> Relever ces valeurs comme la vitesse initiale de la réaction à telle concentration de glucose (N’oubliez pas la valeur de la concentration en glucose qui lui correspond).
> Relever vos valeurs dans un tableur, (colonne 1 concentration en glucose, colonne 2 vitesse initiale correspondante)
> Réaliser un graphique des vitesses en fonction de la concentration en glucose,
Vi = F([Glucose]).
> Déterminer le Km de l’enzyme.

[1Attention, à n’injecter qu’après avoir lancer la manip !!

[2cliquer sur l’icône correspondant à l’oxymètre et dans le menu de gauche faire les réglages

[3cliquer sur l’icône correspondant au temps et dans le menu de gauche faire les réglages

[4Les solutions se trouvent sur les paillasses du fond dans des flacons avec bulleur pour maintenir une quantité suffisante d’oxygène