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Réaction de Hill [Protocole]

jeudi 18 septembre 2014 par flouveau [ télécharger l'article au format PDF]

La Réaction de Hill permet de mettre en évidence le rôle prépondérant de l’accepteur d’électron (NADP).
Principe :
Dans les chloroplastes, l’accepteur d’électrons est le NADP+. Lors du broyage destiné à extraire les chloroplastes, les chloroplastes sont lésés et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaît. La chaîne réactionnelle est donc bloquée. L’adjonction d’un accepteur d’électrons, ici le ferricyanure de potassium, rétablit la chaîne réactionnelle et donc le dégagement d’O2, lors de l’illumination. Cette expérience réalisée pour la première fois par Hill démontre la réalité des processus d’oxydo-réduction liés au couplage de l’absorption d’énergie lumineuse et de la production d’énergie chimique.
La mesure de l’évolution du taux de O2 (production de O2 = activité photosynthétique) dans une suspension de thylacoïdes, se fait en présence ou en absence d’un accepteur d’électrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----> Fe2+), et en alternant des phases d’éclairement et d’obscurité.

Matériel

- Verrerie courante (Erlenmeyer, entonnoir, éprouvette graduée, cristallisoir, mortier pilon)
- Glaçon pour l’erlenmeyer lors de la filtration, et la conservation du matériel
- réactif de Hill, Tampon saccharose
- Feuilles épinards.
- Matériel ExaO (ordinateur, interface d’acquisition, capteurs, logiciel de traitement..)
- Bioréacteur, seringue, éprouvette graduée.
- Une fiche technique généraliste de cette manipulation.

Paramétrage du logiciel d'acquisition

 !! Le matériel doit être refroidi (réfrigérateur) : le bol du mortier, la cuve du bioréacteur, les tampons ainsi que les feuilles de végétal, doivent être froids lors de l’expérience, de manière à ralentir la dégradation de la chlorophylle après extraction !!

1→ On utilisera le module métabolisme (Fiche Technique spécifique de ce module), onglet concentration.

Remarque : On peut aussi utiliser la module généraliste, dans ce cas il faut indiquer les capteurs à utiliser en les faisant glisser dans le repère dans la phase de paramétrage, -> Placer l’adaptateur oxymètre sur l’axe des ordonnées en cliquant sur l’icône « Oxymètre » puis en déplaçant la souris en maintenant ce clic. (Les 6 points d’accroche sur l’axe des ordonnées étant équivalents, vous pouvez donc placer l’adaptateur oxymètre sur celui de votre choix.) De même positionner l’icône « Temps » sur l’axe des abscisses (2)

2→Paramétrer les capteurs :
- vérifier que l’oxymètre soit sur "liquide" (cliquer sur l’icône, onglet calibre puis liquide)
- Régler la durée d’acquisition sur 7 minutes .
- Cocher la case intensité lumineuse.

Réalisation de l’expérience

1- Remplir la cuve du bioréacteur avec le filtrat de façon à faire déborder la cuve une fois le couvercle positionnée (environ 13 ml)

2- Brancher le bioréacteur et lancer l’agitation (homogénéisation)
bioreacteur_agitateur {JPEG}

3- Placer la sonde 02 dans l’enceinte par l’un des emplacements situés dans le couvercle du bioréacteur. Éviter d’utiliser l’emplacement central sous lequel se trouve l’agitateur.
Placer la sonde photométrique pour mesurer la lumière.

NB : La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioréacteur ! Elle dispose d’un joint noir qui permet de l’éviter.

bioreacteur _ dispo

4- Lancer la mesure en cliquant sur bouton démarrer.

5- Laisser les volets fermés (obscurité). Au démarrage puis les ouvrir au bout d’une minute.
A chaque manipulation vous pouvez insérer un repère, l’icone est sur la partie de gauche

6- Laisser les volets ouverts pendant une minute, puis à l’issue de cette minute injecter 1mL de réactif de Hill (accepteur d’électron). Mettre un repère sur l’axe des temps, en appuyant sur la barre d’espace.

NB : un petit orifice est prévu à cet effet dans le couvercle du bioréacteur, ce qui évite d’ouvrir le couvercle…
bioreacteur_injection {JPEG}

7- Au bout de 2 minutes, fermer les volets (obscurité)

N.B. : une fois l’expérience terminée, enlever le couvercle de l’enceinte et rincer très soigneusement à l’eau distillée, la sonde, l’agitateur, le couvercle et la cuve.

9- On prendra soin d’annoter la courbe en cliquant sur l’icône « Annotation d’une courbe ». (1) Titre ; (2) Choix de la courbe à annoter ; (3) Annotation à insérer sur la courbe choisie ; (4) Insérer l’annotation en cliquant gauche sur la courbe.

NB : Une vidéo de 98sec qui explique tout cela, mais si vous n’avez pas le temps contenter vous de ce qu’il y a ici...]

Résultats de la manipulation

__Résultats attendus____


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